Jeffrey Cross
Jeffrey Cross

Barato DIY GFP (Green Fluorescent Protein) iluminador

Não foi um fetiche horripilante que me fez ler o The Worm Breeder's Gazette.Em vez disso, conversava com Kathryn Hedges - uma cientista e artista inteligente, apaixonada e bem credenciada - sobre The Gazette’s dicas sobre como fazer um iluminador GFP barato. GFP, ou proteína verde fluorescente, é um marcador fluorescente freqüentemente usado em biologia molecular e neurociência.

Durante o seu programa de mestrado na Universidade Estadual de Humbolt, Kathryn, como muitos outros pesquisadores científicos, foi desafiada por cortes orçamentários e pela dificuldade de encontrar apoio financeiro. A fim de continuar seu trabalho com neurônios nematódeos em um departamento carente de dinheiro, quando ela tinha uma necessidade de 11 horas por novos equipamentos, Kathryn desencadeou o poder de sua mentalidade “vamos ver como podemos fazer isso melhor e mais barato” para hackear o DIY? Iluminador GFP em um sistema melhor, digno de pesquisa, capaz de visualizar neurônios em minúsculos vermes de apenas 1 milímetro de comprimento.

Por que isso era importante para Kathryn? Em suas palavras, "uma das minhas cepas continuava selecionando contra a GFP se eu não selecionasse manualmente os vermes mais brilhantes de cada geração. Sem uma maneira de ver a GFP no microscópio “dissecante”, onde eu pegava vermes individuais com uma minúscula espátula de arame, eu não podia garantir que toda a sua progênie seria fluorescente, o que é um problema quando estou tentando ver se um tratamento os danifica para fazê-los perder a fluorescência ”.

O resultado: “Os únicos microscópios que tínhamos com capacidade GFP eram inadequados para ampliar worms enquanto os movíamos, e comprar um escopo adequado teria custado milhares de dólares. Eu tinha US $ 750 em meu orçamento, então gastei cerca de US $ 80 em peças de LED e construí um iluminador. Não era brilhante o suficiente para ver células longas e finas, então gastei US $ 825 em filtros de alta qualidade, recuperei uma ocular antiga de microscópio como lente de foco e usei acessórios de encanamento para montá-la em um micromanipulador que tínhamos no laboratório. Então eu poderia selecionar meus minhocas mais brilhantes, criar larvas de verme confiantemente brilhantes e terminar minhas experiências. Se eu estivesse rastreando um recurso maior no GFP ou estivesse usando o Red Fluorescent Protein, provavelmente poderia ter usado filtros baratos e feito a coisa toda abaixo de US $ 100. Se eu fosse continuar meus experimentos, eu poderia usar este iluminador quando cruzar as linhagens GFP para ver qual progênie tem os dois marcadores GFP ”.

O orientador de tese de Kathryn encorajou esse tipo de experimentação, pois ele e seu próprio orientador de tese desenvolveram seus próprios equipamentos de bricolage para detectar a velocidade de condução nervosa em um pequeno anelídeo de água doce. O protótipo ainda está pendurado em um quadro de avisos sobre sua mesa. Ele não apenas ensina aos estudantes de fisiologia animal como fazer a neurofisiologia de maneira não invasiva, como também ele e seus alunos de pesquisa publicaram artigos usando esse método para coletar dados. Ele é fã do Backyard Brains Spiker Box e espera vê-lo em ação.

Ao cortar sua própria ferramenta, sem passar pela despesa muito alta de comprar um iluminador médio por milhares de dólares (até usado), Kathryn foi capaz de terminar sua tese. O iluminador é útil para qualquer cientista de DIY que precise visualizar a expressão dos genes GFP ou RFP (Red Fluorescent Protein) em bactérias ou c. elegans. E Kathryn é a prova de que você pode fazer isso em um centavo.

Detalhes sobre o iluminador GFP básico de A gazeta dos criadores de vermes estão abaixo (após o salto). Para saber mais sobre as melhorias de Kathryn e ver suas anotações sobre worms, confira a postagem dela Cores esplêndidas.

[Crédito para Ian Chin-Sang e Weiwei Zhong]

Usando LEDs como uma fonte de baixo custo para detectar GFP e DsRED

Ian Chin-Sang1 e Weiwei Zhong Departamento de Biologia, Queen's University, Kingston, ON, Canadá, 2Departamento de Bioquímica e Biologia Celular, Rice University, Houston TX Correspondência para: Weiwei Zhong ([protegido por e-mail])

Os componentes de detecção de fluorescência são muito caros para serem instalados em todos os estereoscópios. Muitas vezes, nossos marcadores fluorescentes são muito brilhantes e não exigem a capacidade total de tal equipamento. Aqui apresentamos uma configuração de LED que custa apenas cerca de US $ 100 e pode detectar marcadores fluorescentes brilhantes, como myo-2 :: GFP. A configuração (Fig. 1) consiste em:

  • X-acto ajudando as mãos ou qualquer coisa que possa posicionar o LED (Amazon.com)
  • Cabo da lâmpada que possui um interruptor (loja de ferragens local)
  • Driver de LED Xitanium de 17 watts (fonte de LED)
  • Conector do driver Xitanium (fonte de LED)
  • Dissipador de calor (fonte de LED)
  • Lente pontual (fonte de LED)
  • Porta óptica Luxeon V Star (fornecimento de LED)
  • LED Estrela Real Azul-Luxeon V para detecção de GFP (LED Supply), ou LED Green Luxeon V Star para detecção de dsRED (LED Supply)
  • Filtro de excitação opcional: Roscolux # 4290 CalColor 90 Blue para GFP ou # 389 Chroma Green para dsRED (Rosco.com | Edmund Optics)
  • Filtro de emissão: Roscolux # 12 Palha para GFP, ou # 19 Fire para dsRED (disponibilidade igual a filtros de excitação)

Detalhes sobre como montar esse dispositivo podem ser encontrados aqui e aqui.

Fig 1. A configuração do LED

Fig 2. Usando a configuração de LED para detectar myo-2 :: GFP em um animal mIn1.

Fig 3. Usando a configuração do LED para detectar myo-2 :: dsRED.

Ao montar o LED no driver, certifique-se de que o +/- termina no LED e que as extremidades de neutro / linha no cabo da lâmpada correspondem às do driver. Use uma cola não condutora como adesivo de silicone (Devcon, parte No.12045, loja de ferragens local) para colocar o suporte da lente no LED. O filtro de excitação pode ser colado à lente aplicando uma pequena quantidade de cola na borda. O filtro de emissão pode ser simplesmente gravado sob a objetiva do microscópio.

Esta configuração tem uma longa vida útil, não requer tempo de aquecimento ou resfriamento e não possui radiação. No entanto, só pode detectar sinais fortes. Usamos a configuração para detectar os seguintes marcadores: myo-2 :: GFP (Fig. 2), sur-5 :: GFP, ajm-1 :: GFP e myo-2 :: dsRED (Fig. 3).

Usando LEDs como uma fonte de baixo custo para detectar GFP e DsRED


Bio: Eri Gentry é um empresário de biotecnologia, organizador da comunidade de ciência cidadã e co-fundador do BioCurious, o primeiro hackerspace para biotecnologia, na área da Baía de São Francisco.

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